PCR-ASO
PCR-ASO, PCR/ASO (ang. Polymerase Chain Reaction/Allele-Specific Oligonucleotide - łańcuchowa reakcja polimerazy/oligonukleotyd specyficzny względem allelu) - jest to technika kombinowana służąca do wykrywania polimorfizmów typu SNP w określonych, zamplifikowanych za pomocą PCR fragmentach DNA, za pomocą tzw. sondy allelospecyficznej, czyli ASO. Technika polega na wykonaniu amplifikacji danego odcinka DNA, a następnie analizie produktów za pomocą hybrydyzacji z sondami[1][2][3][4].
Zasada metody
PCR
ASO
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/24/Allele-specific_oligonucleotide_%28sample%29.jpg/419px-Allele-specific_oligonucleotide_%28sample%29.jpg)
ASO (ang. allele-specific nucleotide), czyli sonda allelospecyficzna, to krótki oligonukleotyd, zwykle o długości około 15-17 nt, o niskiej zawartości GC, zwykle około 30-50%, komplementarny do badanej sekwencji[1][4]. Sonda taka zawiera nukleotyd różnicujący, który pozwala odróżnić od siebie poszczególne allele, ponieważ niedopasowanie nawet jednego nukleotydu sprawia, że hybrydy są mniej stabilne[1][2]. Sondy ASO są relatywnie trudne w projektowaniu, konieczne jest testowanie empiryczne z użyciem kontroli pozytywnej i negatywnej, w ściśle określonych warunkach[1]. Sondy zwykle są znakowane radioaktywnie (izotopowo), chemiluminescencyjnie lub fluorescencyjnie, na przykład biotyną (biotynylowanie)[1][4]. Odpowiednio zaprojektowane ASO mogą być używane jako startery w PCR (technikę nazywa się wówczas ASO-PCR, ang. allele-specific oligonucleotide polymerase chain reaction, lub ARMS-PCR, ang. amplification refractory mutation system PCR)[1][6][7][8]. W badaniu każdej mutacji typu SNP stosuje się parę sond - jedną komplementarną do allelu dzikiego (prawidłowego), drugą do allelu zmutowanego[3].
PCR-ASO
Technika polega na amplifikacji fragmentu materiału genetycznego za pomocą PCR, a następnie hybrydyzacji produktów z sondami ASO. Amplifikację prowadzi się w taki sposób, aby badany pod względem polimorfizmu fragment zawarty był pomiędzy użytymi starterami - gdyby polimorfizm występował w obrębie któregoś ze starterów, amplifikacja niekomplementarnych form mogłaby się nie powieść, fałszując wyniki (w przypadku heterozygot) lub nawet uniemożliwiając dalszą analizę z powodu braku produktu (homozygota zawierająca allel niekomplementarny do użytego startera)[1].
PCR-ASO występuje w dwóch odmianach:
- forward ASO - zamplifikowany fragment DNA jest immobilizowany (unieruchamiany) na membranie w postaci spotów (punktów, kropek), a następnie nanoszone są znakowane sondy w postaci roztworu;
- reverse ASO - na membranie immobilizowane są w postaci spotów różne sondy, a następnie nanoszony jest znakowany zamplifikowany fragment DNA w postaci roztworu[1].
W przypadku obu odmian PCR-ASO mniej stabilne hybrydy są rozdzielane poprzez wymywanie w ścićle określonych, dopasowanych eksperymentalnie do konkretnego układu warunkach, a wyniki odczytywane są na podstawie tego, które spoty generują dany sygnał[1][2]. Na membranie pozostaną hybyrydy wyłącznie w tych spotach, w których sonda i badany fragment (próbka) były do siebie w pełni komplementarne[1].
Czynniki istotne podczas hybrydyzacji oraz przemywania membrany to:
Forward ASO
W przypadku odmiany forward źródłem sygnału są znakowane sondy. Jeżeli poszczególne sondy są znaczone np. różnymi fluoroforami dla kolejnych wersji (alleli) badanej sekwencji, można w jednym eksperymencie użyć kilku sond. Wówczas konkretny kolor fluorescencji będzie wskazywał jaka sekwencja DNA znajduje się w danym spocie. Odmiana forward pozwala ponadto nanieść na membranę wiele próbek różnego pochodzenia - możemy więc jednorazowo zbadać więcej niż jednego osobnika. Ta odmiana PCR/ASO przydaje się zwłaszcza gdy analizuje się wiele różnych próbek pod kątem niewielkiej liczby alleli, gdyż każdy kolejny zestaw sond wymaga dodatkowego cyklu hybrydyzacji[1].
Na początku stosowano znakowanie izotopowe, a wyniki otrzymywano na błonie rentgenowskiej. Inne protokoły wykorzystywały biotynylację sond, wizualizacja następowała za pomocą streptawidyny i peroksydazy chrzanowej - wyniki odczytywano za pomocą kolorymetrii[1].
Reverse ASO
Ta odmiana wykorzystywana jest, gdy konieczne jest badanie wielu różnych alleli. Sondy można immobilizować na membranie na kilka różnych sposobów, np.:
- sondy mają tzw. ogon poli-T na końcu 3' i są mocowane do membrany za pomocą promieniowania UV;
- przez grupę aminową dodaną na końcu 5'[1].
Analizowane produkty PCR mogą być znakowane analogicznie jak sondy w odmianie forward.
Procedura
Etapy analizy
Krok | PCR/ASO forward | PCR/ASO reverse |
---|---|---|
1. | Reakcja PCR - amplifikacja próbki | |
2. | Osadzenie próbki na membranie | Osadzenie sond na membranie |
3. | Naniesienie znakowanych sond | Naniesienie znakowanej próbki |
4. | Odpłukanie słabiej związanych sond | Odpłukanie słabiej związanej próbki |
5. | Wizualizacja hybryd metodą właściwą dla sposobu znakowania | |
6. | Analiza wyników |
Interpretacja wyników
Sonda komplementarna dla allelu dzikiego | Sonda komplementarna dla allelu zmutowanego | |
---|---|---|
Homozygota typu dzikiego | + | - |
Homozygota zmutowana | - | + |
Heterozygota | + | + |
+ wynik pozytywny, czyli powstanie hybrydy,
- wynik negatywny, czyli brak hybrydy.
Wady i zalety
PCR/ASO jest wydajną metodą do badań przesiewowych i rutynowych analiz - jest bardziej uniwersalną metodą wykrywania polimorfizmów typu SNP niż RFLP (w przypadku RFLP mutacja musi występować w obrębie sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny) oraz tańszą niż sekwencjonowanie, jakkolwiek trudności nastręcza optymalizacja analizy:
- projektowanie sondy:
- nie może obejmować innych miejsc polimorficznych,
- musi mieć odpowiednią długość oraz zawartość GC;
- projektowanie warunków hybrydyzacji:
- warunki hybrydyzacji muszą być wystarczająco ścisłe, aby umożliwić związanie sondy w pełni komplementarnej, a jednocześnie odpłukanie sondy, która ma zaledwie jeden niekomplementarny nukleotyd;
- konieczność wyboru pomiędzy badaniem dużej liczby próbek a badaniem dużej liczby alleli;
- analiza wyłącznie znanych mutacji[1].
Zastosowanie
Generalnie PCR/ASO wykorzystywane jest w badaniach przesiewowych pod kątem znanych mutacji, m.in.:
- diagnostyka anemii sierpowatej (analiza genu β-globiny),
- diagnostyka nowotworów,
- diagnostyka α-talasemii, β-talasemii,
- diagnostyka mukowiscydozy (analiza genu CFTR)[1][3][5].
Ciekawostki
- Istnieje procedura pozwalająca na przeprowadzenie hybrydyzacji w stopniowo opadającej temperaturze (75-30 °C), co zmniejsza nakład pracy przy optymalizacji procesu; polega ona na dodaniu do roztworu ze znakowaną sondą nieznakowanej sondy specyficznej dla innego allelu - konkuruje ona o związanie się z komplementarną próbką, co zapobiega powstawaniu niespecyficznych hybryd[2].
- Sondy ASO mogą być wykorzystane jako startery w reakcji PCR[6].
- PCR-ASO może być łączone z RFLP[9].
Przypisy
- ↑ a b c d e f g h i j k l m n o A.A. Sgourou A.A. i inni, Low- and Medium-Throughput Variant Detection Methods, Elsevier, 2017, s. 23–39, DOI: 10.1016/b978-0-12-802971-8.00003-1, ISBN 978-0-12-802971-8 [dostęp 2020-11-17] .
- ↑ a b c d e StéphaneS. Bourgeois StéphaneS., DamianD. Labuda DamianD., Dynamic allele-specific oligonucleotide hybridization on solid support, „Analytical Biochemistry”, 324 (2), 2004, s. 309–311, DOI: 10.1016/j.ab.2003.10.006 [dostęp 2020-11-17] (ang.).
- ↑ a b c ABC diagnostyki molekularnej - Artykuły - Laboratoria.net [online], laboratoria.net [dostęp 2020-11-17] .
- ↑ a b c PCR - analiza produktu PCR (ASA, ASO, RFLP) – BioInf [online], bioinfo.imdik.pan.pl [dostęp 2020-11-17] .
- ↑ a b D.Y.D.Y. Wu D.Y.D.Y. i inni, Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia., „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 86 (8), 1989, s. 2757–2760, DOI: 10.1073/pnas.86.8.2757, ISSN 0027-8424 [dostęp 2020-11-17] .
- ↑ a b Y.M. DennisY.M.D. Lo Y.M. DennisY.M.D., The Amplification Refractory Mutation System, t. 16, New Jersey: Humana Press, 2 marca 1998, s. 61–70, DOI: 10.1385/0-89603-499-2:61, ISBN 978-0-89603-499-0 [dostęp 2020-11-17] (ang.).
- ↑ YinleiY. Bai YinleiY., AlbertoA. Orfao AlbertoA., Chor SangCh.S. Chim Chor SangCh.S., Molecular detection of minimal residual disease in multiple myeloma, „British Journal of Haematology”, 181 (1), 2018, s. 11–26, DOI: 10.1111/bjh.15075, ISSN 0007-1048 [dostęp 2020-11-17] (ang.).
- ↑ What is ARMS-PCR or allele-specific PCR? [online], Genetic Education, 27 lutego 2019 [dostęp 2020-11-17] (ang.).
- ↑ J.D.J.D. Bignon J.D.J.D., J.L.J.L. BlDWELL J.L.J.L., COMBINED USE OF RFLP AND PCR-ASO TYPING FOR HLA-DR-Dw AND DQw TYPING, „European Journal of Immunogenetics”, 18 (1-2), 1991, s. 125–138, DOI: 10.1111/j.1744-313X.1991.tb00012.x, ISSN 0960-7420 [dostęp 2020-11-17] (ang.).